Принципы биохимического исследования

Изучение метаболизма ксенобиотиков проводят на самых разных > лабораторных животных — мышах, крысах, морских свинках (из-за их малой стоимости и простоты ухода за ними); наряду с ними для опытов используют также кроликов, кошек, собак и обезьян. Одной из основных проблем, стоящих перед биохимиками и фармакологами, является экстраполяция результатов, полученных на лабораторных животных, к чел

овеку. Многочисленные сравнительные исследования показали, что метаболические процессы у человека и всех исследованных видов животных существенно различаются. Именно по этой причине новые лекарственные препараты, предназначенные для введения человеку, предварительно проходят испытание не на одном животном, а на целом ряде различных лабораторных животных. Только после тщательного сравнительного анализа полученных результатов клинические испытания можно проводить на человеке.

При изучении метаболизма ксенобиотиков удобнее всего вводить их в виде изотопных меток; как правило, вводят препараты, меченные по 14 0С. Экскрецию у мелких лабораторных животных целесообразно изучать с помощью специальной метаболической стеклянной камеры, в которую животное помещают на все время опыта (рис. 1.2). Благодаря особой конструкции камеры моча и фекалии собираются отдельно, а выдыхаемый углекислый газ поступает в специальную ловушку. При изучении меченных по углероду соединений в клетку подается воздух, не содержащий углекислого газа, а выдыхаемый углекислый газ поглощается раствором гидроокиси натрия; анализ выдыхаемого углекислого газа, меченного по углероду (14С02), позволяет установить степень распада изучаемого соединения. Выделяемые с мочой и фекалиями вещества и их метаболиты связаны, как правило, с такими соединениями, как Р-глюкуроновая кислота, глицин, глутатион и сульфат, что повышает растворимость метаболитов в воде, а следовательно, и степень их экскреции. Поэтому перед экстракцией метаболитов органическими растворителями (эфиром или хлороформом) пробы экскрементов нужно гидролизовать, предварительно исследовав их соответствующими аналитическими методами.

Одним из способов изучения путей превращения введенного соединения in vivo является перфузия органов (например, почек или печени), при которой соединение вводят с помощью тонкой полой иглы в артерию, несущую кровь к данному органу, а затем анализируют пробы крови, взятые из соответствующей вены животного.

В Англии существуют инструкции, ограничивающие применение живых позвоночных животных для исследовательских целей; контроль за выполнением этих инструкций осуществляется специальными комиссиями Внутреннего департамента (Министерства внутренних дел Великобритании). Эксперименты на живых позвоночных нельзя проводить без особого разрешения министерства, которое должно быть подписано профессором физиологии (или специалистом смежного профиля) и президентом Королевского общества или его заместителем.

Для изучения распределения введенного соединения животное спустя некоторое время после инъекции умерщвляют с помощью анестезий, декапитации или цервикальной дислокации. Затем проводят исследования либо трупа животного, либо отдельных органов, которые для этой цели изолируют, выявляют морфологические изменения, происшедшие в них, изучают их составные части.

Для получения наглядного представления о распределении введенных мелким лабораторным животным радиоактивных соединений успешно применяется метод авторадиографии препаратов целого организма (разд. 6.2.4). Этот метод позволяет получить данные о распределении и относительном содержании введенного соединения в тканях животного, скорости его выведения и способности проникать сквозь биологические мембраны. Через определенный промежуток времени после введения соединения животное умерщвляют с помощью анестезии и быстро замораживают смесью ацетона с твердым С02 при температуре —78° С или с помощью жидкого азота. Замороженное животное помещают при низкой температуре в водный раствор смолы (аравийская камедь), а после застывания смолы рассекают на соответствующем уровне резцом, прикрепленным к электродрели, или делают секционные срезы с помощью микротома со специальным лезвием из карбида вольфрама. Полученный срез прикладывают к рентгеновской пленке и оставляют на 1—2 нед при низкой температуре, после чего пленку проявляют. Сопоставляя полученную авторадиограмму с цветным снимком среза, изучают распределение и локализацию введенного животному изотопа в различных его органах и тканях. Типичная авторадиограмма изображена на рис. 1.3.

4. Изотонические солевые растворы

При проведении экспериментов на органах животных, срезах растительных и животных тканей, гомогенатах и клеточных органеллах необходимо, чтобы среда для суспендирования имела не только определенный рН, но и заданный ионный состав. Среда должна быть изотонической, т. е. осмотическое давление в ней должно совпадать с осмотическим давлением внутри клетки или клеточной органеллы, чтобы их метаболическая целостность не нарушалась. Кроме того, если, например, изучают рост клеток, среда для суспендирования должна содержать все необходимые основные питательные вещества. Это требование нужно особенно тщательно выполнять при изучении культур клеток и тканей, особенно культур животных клеток.

Существует целый ряд физиологических солевых растворов, многие из которых являются разновидностями одного из первых — раствора Рингера. К ним относятся растворы Тайрода, Янга, Лока, Менга и Да Жалона. Наиболее часто применяются фосфатный и бикарбонатный растворы Кребса—Рингера. По своему ионному составу бикарбонатный солевой раствор близок к сыворотке крови млекопитающих. Фосфатный раствор Кребса—Рингера не является физиологическим, но может с успехом применяться для изучения срезов и гомогенатов тканей в тех случаях, когда поглощение кислорода измеряют манометрическими методами (разд. 8.6.2). Большинство этих солевых растворов содержат в различных количествах NaCl, КС1, MgS04, СаС12, NaHCOs и КН2Р04; некоторые растворы насыщены смесью газов — кислорода и углекислого газа. Кроме того, в их состав могут входить такие соединения, как глюкоза, пируват, фумарат и оксалоацетат. Для исследования культур животных тканей используются растворы Хэнкса и Гей—Эрля. Выбор того или иного раствора вначале является произвольным и не основывается на объективных данных, поэтому перед его применением необходимо убедиться, что состав его оптимален. И, наконец, при проведении физиологических экспериментов нужно следить за тем, чтобы эффекты, наблюдаемые при изменении рН среды, были вызваны изменениями в концентрации ионов водорода, а не какими-либо другими изменениями буферного раствора.

5. Перфузия изолированных органов

Сущность этого метода заключается в том, что изучаемый орган (печень, почку или сердце) изолируют из организма животного и помещают в специальный термостатируемый прибор. Затем к перфузионной жидкости, которая обычно вводится в орган через артерию, добавляют исследуемое соединение и анализируют жидкость, вытекающую из органа через вену, что позволяет проследить за превращениями введенного соединения. Перфузионную жидкость можно пропускать через орган однократно или несколько раз, самотеком или с помощью небольшого насоса. Насос применяют тогда, когда перфузионную жидкость пропускают через орган многократно. В отдельных случаях жидкость прогоняют не при постоянном давлении, а импульсами, что позволяет приблизить условия опыта к ситуации in vivo и имитирует процесс перекачивания крови сердцем.

 Скачать реферат