Принципы биохимического исследования

Для проведения перфузии не обязательно полностью изолировать орган; ее можно проводить и на органе вскрытого анестезированного животного. При этом удается сохранить интактными нервные волокна и часть сосудистой системы.

Действие какого-либо соединения на ткань или орган (например, гистамина на мышцу) можно изучать по механической ответной реакции изолированной ткани на данное соединение. Ис

следуемое соединение добавляют к омывающей ткань жидкости; в ответ на это ткань, закрепленная с одного конца, а другим концом связанная с пером самописца, начинает двигаться, и любое движение ткани постоянно регистрируется на самописце. Данный метод позволяет изучать ответную реакцию изолированных органов на введение очень небольших (порядка нескольких нанограмм) количеств активных соединений. Основным недостатком метода перфузии изолированных органов является отсутствие гормонального и нервного контроля; поэтому при экстраполяции всех полученных результатов к ситуации in vivo следует соблюдать осторожность.

6. Приготовление срезов органов и тканей

Срезы тканей желательно делать как можно тоньше, чтобы обеспечить свободный доступ кислорода в самые глубокорасположенные слои срезов и полное выведение продуктов распада за счет диффузии. Этим требованиям удовлетворяют срезы толщиной от 0,5 до 5 мм; кроме того, в этом случае соотношение между разрушенными и интактными клетками остается достаточно малым.

Исследуемый орган извлекают из организма сразу же после умерщвления животного, чтобы посмертные изменения были минимальными. Срезы делают с помощью лезвия бритвы или микротома, затем переносят в сосуд с подходящей средой суспендирования и изучают их метаболизм и действие введенных соединений на обменные процессы. Тканевые срезы часто исследуют манометрическими методами (разд. 8.6.2); при этом, поскольку срезы бывают недостаточно тонкими, для создания аэробных условий и обеспечения кислородом глубокорасположенных слоев клеток приходится применять газовые смеси, содержащие до 95% кислорода. Недостатком данного метода является то, что внешние слои клеток срезов находятся в среде с токсической концентрацией кислорода.

7. Использование растительного материала

Выбор методов при изучении метаболизма у растений определяется в основном степенью организации растения. Одноклеточные и многоклеточные водоросли, например, хорошо растут на простых, чаще всего неорганических питательных средах при соответствующих внешних условиях. Такие водоросли можно рассматривать как интактные организмы; они имеют относительно простое строение и являются удобным экспериментальным материалом для изучения фундаментальных биохимических процессов, которые трудно исследовать на высокоорганизованных растениях. В качестве классического примера можно привести такие растительные организмы, как Scenedesmus и Chlorella, которые используются для изучения фиксации углекислого газа. Эти системы благодаря удобству контроля за их ростом и простоте поставки экзогенных соединений клеткам особенно удобны для изучения действия на обмен веществ таких факторов, как освещение, температура, питание и т. д.

На более высоких уровнях организации — у высших растений— доставка экзогенных соединений в соответствующий участок внутри растения в значительной степени затруднена. Если растение растет в почве, исследуемое соединение в виде раствора вносят в эту почву, откуда оно затем всасывается корнями. Другой способ состоит в том, что растение извлекают из почвы и корни помещают в раствор исследуемого соединения на определенный период времени. Раствором соединения можно опрыскивать растение или наносить его непосредственно на листья. Для изучения распределения соединения и его метаболитов внутри растительного организма исследуют отдельные его части — корни, побеги, листья, почки и цветы.

Основная трудность, возникающая при изучении метаболизма у растений, заключается в том, что в отличие от тканей животных растительные ткани не содержат достаточно крупных и сложных структур. Отдельные части растения можно изолировать, помещать в соответствующую среду, а затем изучать их метаболизм in vitro. Приготовление срезов, дисков, гомогенатов и выделение клеточных органелл из растительных тканей осуществляют такими же способами, как и из тканей животных.

8. Культуры тканей и клеток

Как мы уже говорили, изучение метаболизма на уровне организма или органа связано с целым рядом трудностей. Иногда это обусловлено еще и тем, что некоторые растения содержат очень мало живой ткани, например ткани меристемы, возникают также трудности доставки соединения в определенный участок растения и контроля за ним. Поэтому выращивание тканей и клеток in vitro имеет ряд преимуществ. В соответствующих экспериментальных условиях можно изучать рост, деление и дифференцию клеток, при этом в значительной степени облегчается доставка соединений к клеткам и тканям и изучение их действия. In vitro можно выращивать большие количества той или иной ткани по сравнению с естественным содержанием ее в интактном организме.

Широкое использование данного метода в эволюционных, физиологических, общемедицинских и фармакологических исследованиях обусловлено тем, что культивирование клеток и тканей позволяет преодолевать многие физические, физиологические и биохимические ограничения, накладываемые сложным строением организма. Метод позволяет изучать потенциал развития клетки, т.е. способность клетки в пределах, обусловленных генотипом, образовывать при соответствующих химических и физических условиях любой другой тип клетки. Несмотря на то что культуры клеток растительных и животных тканей мало чем отличаются друг от друга, клетки растительных тканей могут размножаться в менее сложных средах, чем клетки тканей животных.

Культуры отдельных частей растения, например корня или меристемы, получают, помещая вырезанные части растения в стерильных условиях в питательную среду, поддерживающую их рост и развитие. В таких средах, которые бывают жидкими или полужидкими, можно выращивать также изолированные растительные и животные клетки. Питательные среды имеют довольно сложный химический состав; как правило, они содержат источник углерода (например, сахар), смесь неорганических солей, микроэлементы, витамины и факторы роста.

Часто в культуральные среды вносят сложные питательные добавки: к культурам животных клеток добавляют сыворотку крови, а к культурам растительных — кокосовое молоко. Чтобы обеспечить полную воспроизводимость данных, лучше всего там, где это возможно, пользоваться питательной средой постоянного состава. В подходящей среде в процессе роста и деления клеток образуются группы клеток, на которых и проводят исследование. Если культуру необходимо аэрировать (например, когда она представляет собой жидкую суспензию), коническую колбу или специальный сосуд с суспензией встряхивают или вращают. В тех случаях, когда требуется получить дезагрегированную суспензию, в раствор добавляют определенные ферменты, например трипсин к суспензии животных клеток или пектиназы к суспензии растительных.

 Скачать реферат