Принципы биохимического исследования

Молекулы белка всегда изучают в буферных растворах; при этом важно установить изоэлектрическую точку, поскольку, на пример, именно при этом значении рН создаются наиболее благоприятные условия для взаимодействия между противоположно заряженными группами соседних молекул, что ведет к их последующей агрегации и быстрому осаждению.

Агрегацию, а следовательно, и осаждение белковых молекул можно

вызвать добавлением к раствору белка солей, например сульфата аммония. Молекулы белка и неорганические ионы при гидратации конкурируют за молекулы воды, и по достижении определенной концентрации соли взаимодействия белок — белок начинают преобладать над взаимодействиями белок — вода, что приводит к агрегации, а затем и осаждению белка. Этот метод широко применяется на начальных стадиях очистки белков. Различия в изоэлектрической точке разных белковых молекул используются при разделении белков с помощью электрофореза.

2. Подходы к биохимическому исследованию

Как мы уже говорили, активность клетки зависит от взаимодействия ее как с непосредственным окружением, так и с клетками, значительно удаленными от нее; кроме того, играет роль также и то, какие методы применяются для ее изучения. Поэтому чтобы получить наиболее полное представление о состоянии клеток внутри органов и тканей, опыты лучше всего проводить на интактных изолированных органах и тканях. Преимущество такого изучения заключается в том, что при этом удается избежать нежелательных эффектов, обусловленных изменением непосредственного тканевого окружения, как это имеет место, например, при фракционировании клеток. Исследование на уровне целых организмов не только не нарушает целостности тканей, но позволяет изучать отдельные органы и ткани, оставляя без изменения снабжение их питательными веществами, нервную и гормональную регуляцию и т. д. Таким образом, чтобы получить полную картину клеточного обмена, необходимо провести исследование на целом организме, изолированном органе, на уровне клетки, клеточной органеллы, на молекулярном и атомном уровнях.

На рис. 1.1 показаны пути биохимических подходов к изучению возможных превращений какого-либо экзогенного соединения (ксенобиотика) в организме животного или его действия на этот организм. Существуют два подхода, которые взаимно дополняют друг друга.

Первый из них заключается в том, что животному вводят соединение, а затем выделяют и идентифицируют все продукты, выводимые из организма. В других случаях спустя некоторое время после введения соединения животное умерщвляют, выделяют и фракционируют нужный орган или ткань, а затем изучают судьбу введенного соединения или исследуют его действие на интересующую субклеточную систему.

Второй подход состоит во введении соединения на одном из указанных на рис. 1.1 уровнях (т. е. в соответствующий изолированный орган, гомогенат, органеллу или субклеточную систему) и изучении действия этого соединения или путей его превращения на данном или более низких уровнях.

Действие какого-либо соединения можно исследовать на нескольких клеточных частицах или органеллах, каждую из которых необходимо для этого выделить из системы и подвергнуть анализу.

Зачастую исследуемое соединение представляет собой природный метаболит или входит в состав самого организма, а иногда является изотопом составного компонента организма. С другой стороны, не всегда действие какого-либо экзогенного соединения на функционирование организма представляет интерес для биохимика. В любом случае изучение можно проводить на любом из вышеуказанных уровней организации, а получаемые на каждом уровне результаты помогают составить более полное представление о процессах, протекающих в организме.

3. Исследования на уровне целого организма

Биохимические эксперименты на животных могут быть предприняты с различными целями. Применяя в течение длительного времени специальную диету, лишенную определенных витаминов или микроэлементов, и одновременно регистрируя возникающие при этом физиологические и клинические изменения, можно исследовать метаболическую роль данного витамина или микроэлемента. Вместе с тем, вводя животному какое-либо экзогенное соединение, можно изучать как влияние этого соединения на организм животного (фармакологическая или патологическая ответная реакция), так и влияние организма на введенное соединение, т. е. его превращения и выведение. В последнее время, главным образом благодаря созданию комитета Данлопа (ныне Комитет по безопасности применения лекарственных средств) после известной трагедии с талидомидом, все большее внимание стали уделять вопросам о том, каким образом различные лекарственные вещества, пищевые добавки и красители, а также такие соединения, как ДДТ, накапливаются в пище и метаболизируются, где они локализуются, какое разрушающее действие оказывают на органы и ткани и какие тератогенные и канцерогенные побочные эффекты могут вызывать.

Единственным способом исследовать пути превращения введенных соединений у человека является определение содержания этих соединений и их метаболитов в крови, моче, фекалиях, желчи, выдыхаемом воздухе, поте и слюне. О поражении органа судят по изменению содержания в сыворотке крови таких ферментов, как аспартат—аминотрансфераза и лактатдегидрогеназа. После введения соединений лабораторных животных умерщвляют, а затем исследуют изолированные органы.

Результаты, получаемые при анализе содержания каких-либо соединений и их метаболитов в биологических жидкостях и экскрементах живых организмов, в том числе и организма человека, зависят от многих взаимосвязанных факторов. К этим факторам относятся:

Способ введения соединения (перорально или путем внутривенной, внутримышечной, подкожной или внутрибрюшинной инъекции).

Скорость всасывания соединения в кровоток; если соединение вводят не внутривенно, то оно должно проникнуть (обычно путем пассивной диффузии) по крайней мере через одну мембрану (если соединение представляет собой слабый электролит, то оно должно пройти через мембрану в неионизованной форме).

Степень связывания соединения с сывороточным альбумином.

Кровоснабжение тканей.

Способность данного соединения проходить через мембраны и распределяться в межклеточных и внутриклеточных жидкостях.

Накопление соединения в жировой ткани и характер его связывания с нуклеиновыми кислотами и меланином.

Скорость метаболизма соединения (главным образом ферментной системой микросом печени).

Скорость выведения (с мочой и желчью).

Совокупность вышеперечисленных факторов создает характер.

Для данного соединения «фармако-кинетическую» картину. Помимо всего перечисленного, имеют значение также возраст, пол, режим питания, физические нагрузки, генетическое строение животного, а также время дня, когда животному было введено соединение (ввиду наличия у животных циркадного ритма). Оказалось даже, что превращение введенного соединения у животных, содержащихся в клетках с мягкими опилками, происходит быстрее, чем у животных, помещенных в клетки с жесткими опилками. Именно благодаря огромному многообразию переменных эксперименты всегда следует проводить не на одном животном, а на целых группах. Исследования нужно проводить на животных чистых линий, а получаемые экспериментальные данные подвергать тщательной статистической обработке. Результаты анализа фармакологического действия введенных экспериментальным животным соединений необходимо сопоставлять с данными, получаемыми в группе контрольных животных, которым было введено плацебо, т. е. совершенно нейтральное вещество, например лактоза.

 Скачать реферат