Методы генной инженерии

Введение

Современный экспериментатор нередко располагает лишь ничтожными количествами исходных препаратов индивидуального белка или ДНК. Например, в случае биопсии ткани человека или редкого штамма бактерии, плохо поддающейся выращиванию в объеме.

Между тем физические методы исследования требуют, хотя и на порядок величины меньшего количества биологического материала, чем два д

есятилетия назад, но, все-таки, зачастую во много раз большего, чем имеется в наличии. Кроме того, многие эксперименты имеют поисковый характер, когда необходимо обследовать сотни, если не тысячи, параллельных проб, варьируя условия поиска.

Все это привело к разработке методов многократного и точного воспроизводства структуры индивидуального белка или фрагмента ДНК, например отдельного гена. Ради экономии времени эти методы в значительной степени автоматизированы. Большинство из них используют подходы генной инженерии. Поэтому эта глава будет посвящена знакомству с понятиями и методами этой сравнительно новой области биологической науки.

Рестриктазы

В середине 70-х годов было сделано странное и не сразу понятое во всей своей значительности открытие. Из некоторых бактерий удалось выделить ферменты, обладающие способностью «разрезать» двойную спираль ДНК любого происхождения, т. е. способностью разрывать сахаро-фосфатные цепочки в обеих нитях. Условием такого разрезания оказалось наличие в этой ДНК короткой, но вполне определенной последовательности нуклеотидов (считая по одной из нитей в направлении 51—3'), так называемого «сайта узнавания» рестриктазы. Этот сайт может насчитывать от 4-х до 8 нуклеотидов. Ошибочно думать, что столь короткие последовательности должны встречаться очень часто. Даже серия из 4-х, наперед заданных нуклеотидов имеет реальный шанс появиться лишь один раз на отрезке ДНК длиной в 44 = 256 пар оснований. Для одной из наиболее часто используемых рестриктаз (EcoRl), сайт которой (ГААТТЦ) насчитывает 6 нуклеотидов, такой шанс появляется в среднем один раз на участке ДНК длиной в 46 = 4 096 пар оснований. Для некоторых рестриктаз (тип I и III) место разреза не однозначно связано с положением сайта узнавания. Такие рестриктазы неудобны для исследовательских целей. У типа II разрез локализован в самом сайте узнавания, что делает эту операцию определенной.

Два последних десятилетия поиск новых рестриктаад производился столь интенсивно, что к концу 1999 года их было найдено и очищено более 2 500. Такое изобилие обусловлено множеством видов бактерий, у которых рестриктазы служат средством защиты от вторжения в них вирусов, чью ДНК они и разрушают/ Для исследовательских целей в настоящее время используют около 300 рестриктаз, которые имеются на рынке биохимических препаратов.

Некоторые из рестриктаз разрезают обе нити ДНК в одном месте, точно ножом. У других — места разреза могут быть сдвинуты на одной нити ДНК относительно другой (в пределах сайта узнавания). В первом случае говорят о «тупых» концах разреза, во втором — о «липких» концах обеих нитей в области разреза. Название «липкие» отражает тот факт, что образующиеся в этом случае на каждой из нитей короткие однонитевые последовательности нуклеотидов, очевидно, комплементарны друг другу и могут, вообще говоря, вновь соединиться водородными связями между основаниями. Хотя это, конечно, не восстановит целостности разрезанного участка ДНК. По крайней мере до тех пор, пока уже знакомый нам фермент ДНК-лигаза не «зашьет» сделанные рестриктазой разрезы на каждой из нитей.

Могущество новообретенного инструмента для исследований было вполне оценено, когда примерно в те же годы было сделано второе важнейшее открытие — существование плазмид у бактерий.

Плазмиды

Было обнаружено, что у многих видов бактерий помимо основной массы ДНК, находящейся в «бактериальной хромосоме» (несколько миллионов пар оснований) имеются еще «крошечные» кольцевые, двунитевые и суперскрученные молекулы ДНК. Они были названы плазмидами — по месту расположения их в протоплазме клетки. Количество пар оснований в плазмидах ограничено диапазоном от 2-х до 20-ти тысяч. Некоторые бактерии имеют только по одной плазмиде. В других — их обнаруживается несколько сотен.

В норме плазмиды редуплицируются при делении бактериальной клетки одновременно с основной ДНК хромосомы. Для своего размножения они используют «хозяйские» ДНК-полимеразы I, III и другие ферменты. Плазмиды синтезируют свои специфические белки, для чего используется РНК-полимераза и рибосомы, также принадлежащие бактерии-хозяину. В числе этих «продуктов деятельности» плазмид иногда оказываются вещества, разрушающие антибиотики (ампимицин, тетрациклин, неомицин и другие). Что придает самой бактерии-хозяину устойчивость против воздействия этих антибиотиков, если она сама по себе таковой устойчивостью не обладает. Мало того. «Самостоятельность» некоторых плазмид простирается до того, что они оказываются способными размножаться в клетке бактерии даже тогда, когда синтез белка в ней (а следовательно, и ее деление) блокированы действием специфических ингибиторов. В этом случае в бактерии может накопиться до 2-3 тысяч плазмид.

Очищенные плазмиды способны проникать из питательной среды внутрь клеток чужеродных бактерий, там обосновываться и нормально размножаться. Правда, для этого приходится предварительно увеличивать проницаемость оболочек этих бактерий, обрабатывая их раствором хлористого кальция.

Успешное встраивание чужой плазмиды удается лишь для ничтожного меньшинства клеток обрабатываемой популяции. Однако если бактерия-реципиент не обладала устойчивостью к определенному антибиотику, а «прижившаяся» плазмида эту устойчивость ей сообщает, то даже из единичных успешно «трансформированных» бактерий на питательной среде с добавкой антибиотика можно вырастить вполне полноценные колонии, наследственно обладающие встроенной плазмидой.

Наконец, самое важное. Если в ДНК плазмиды (до начала трансформации) удастся «встроить» фрагмент вовсе чуждой для нее ДНК (например ген животного происхождения), то этот фрагмент вместе с плазмидой войдет внутрь клетки реципиента, вместе с ней будет размножаться и направлять внутри бактерии синтез «псевдоплазмидных» белков, закодированных в этом гене!

Вспомним теперь с какой скоростью размножаются бактерии в жидкой питательной среде, поддерживая и приумножая при этом синтез плазмидных (а также «псевдоплазмидных»!) белков. Очевидно, что здесь просматривается перспектива наработки большого количества индивидуального белка — продукта деятельности вторгнувшегося («тайком») в бактерию гена. Остается решить проблему встраивания именно избранного гена в плазми-ду. А также и получения первоначально необходимого количества этого самого гена, если отправным пунктом является известная (хотя бы частично) структура интересующего нас белка. Вот тут-то и раскроются уникальные возможности использования рестриктаз.

Но сначала несколько слов о выделении самих плазмид из клеток их нормальных бактерий-хозяев. Это — дело не сложное. Из бактерии можно очистить суммарную ДНК, как это было описано раньше. Потом одним из физических методов отделить низкомолекулярную ДНК плазмид от сравнительно высокомолекулярной ДНК бактериальной хромосомы. Надо только позаботиться о том, чтобы при вскрытии клетки не появились малые обломки основной ДНК. В частности, не следует пользоваться для разрушения оболочек бактерий ультразвуком.

 Скачать реферат