Методы генной инженерии

Можно поступить проще. Сферопласты бактерий обработать слабой щелочью + DDC-Na или прокипятить в течение 1 минуты. ДНК бактериальной хромосомы, вместе со связанными с ней белками, денатурируется и выпадает хлопьями в осадок. Ее легко удалить центригурированием. ДНК кольцевых плазмид также сначала денатурируется. Но поскольку ее однонитевые кольца топологически связаны, они разойтись не могут. П

осле восстановления нормальных условий среды ренатурируется и нативная структура плазмид. Они остаются в растворе.

За последние годы выделены и очищены сотни плазмид. Их описание, естественно, начинается с представления полной нуклеотидной последовательности плазмидной ДНК. Современ-ные автоматические «секвенаторы» позволяют расшифровать последовательность 4-х-5-ти тысяч пар нуклеотидов за неделю. В 80-е годы, когда секвенирование ДНК производили вручную, такая работа занимала несколько месяцев.

Подробные данные о каждой новой плазмиде, включая и карту расположения ее собственных генов, заносят в международную «библиотеку плазмид».

Встраивание фрагмента чужеродной ДНК в плазмиду

С помощью библиотеки плазмид можно без труда отыскать такую плазмиду, в ДНК которой имеется (случайно) сайт узнавания для одной из доступных рестриктаз. Для рестриктаз тоже есть своя библиотека и, как уже упоминалось, порядка 300 их видов имеется в продаже. Таким образом у исследователя имеются широкие возможности выбора наиболее удобной комбинации плазмиды и рестриктазы.

Далее разрезают выбранной рестриктазой удобную плазмиду так, чтобы образовалось два «липких» конца. Затем нужно снабдить такими же концами фрагменты встраиваемой ДНК. Хорошо, если по обоим концам этого фрагмента расположатся сайты узнавания выбранной рестриктазы. Но это случай маловероятный. Поступают следующим образом. К собственным окончаниям имеющегося фрагмента ДНК наращивают двунитевые участки искусственных (синтезированных химически) олигонуклеотидов. Заведомо содержащих сайты узнавания выбранной рестриктазы. Затем действием этой самой рестриктазы их превращают в «липкие» концы — в точности соответствующие липким концам плазмиды по обе стороны сделанного в ней разреза. (Рассказать о том как наращивают концы фрагмента ДНК было бы, пожалуй, слишком сложно для нашего курса. Зато я немного позже постараюсь пояснить каким образом синтезируются искусственные олигонук-леотиды с наперед заданной последовательностью пар оснований.)

Итак, далее в буферном растворе смешивают две ДНК, — плазмиды и вставки, — и выдерживают их при оптимальной температуре «гибридизации». Чужеродная ДНК «встраивается» в ДНК плазмиды, хотя и может превышать ее по длине, т. е. достигать размера в несколько тысяч пар оснований. Окончательное слияние, «приживание» новой ДНК, разумеется, обеспечивают ДНК-лигазы.

Я употребил термин «гибридизация». Что он обозначает в данном случае? Условимся называть так образование двухнитевой структуры в результате контакта двух комплементарных однонитевых последовательностей нуклеотидов, типа ДНК-ДНК или ДНК-РНК. Термин «комплементарные» нам уже знаком. Последовательности могут быть одинаковой длины, тогда образуется сплошь двухнитевой «гибрид». А могут быть и существенно различными по длине. В этом случае образуется «участок гибридизации», соответствующий длине более короткого из двух партнеров. Минимальная длина участка гибридизации, при которой он достаточно устойчив, — это 8-10 пар нуклеотидов. Впрочем, для устойчивой гибридизации комплементарных липких концов двух молекул ДНК эту цифру можно уменьшить вдвое, так как двунитевые структуры самих ДНК будут поддерживать новообразованный короткий участок гибридизации.

Может возникнуть вопрос: а почему сама разрезанная плаз-мида не восстанавливает кольцевую структуру путем гибридизации своих собственных липких концов? Ну, во-первых для сравнительно короткой ДНК плазмиды не так-то просто, распрямившись, самопроизвольно снова свернуться в кольцо. Во-вторых, встраиваемый фрагмент ДНК берется в большом избытке с тем, чтобы процесс встраивания в плазмиду имел конкурентное преимущество по отношению к процессу восстановления плазмиды. С этой же целью 5'-фосфатные группы из места разреза плазмиды убирают действием еще одного фермента — «щелочной фосфата-зы». Поначалу достаточно, чтобы соединилась одна пара липких концов, принадлежащих плазмиде и встраиваемой ДНК. Со временем, непременно, благодаря тепловым движениям соединится и вторая пара.

И все-таки поставленный вопрос не напрасен. Полностью избежать «реставрации» пустых плазмид, действительно, не удается. К счастью найден способ различать среди колоний бактерий, выросших на среде с антибиотиком, те, которые приютили « пустую « плазмиду от тех, что получили плазмиды со встроенным фрагментом чужой ДНК. Способ этот очень красив. Идея его такова. Некоторая модификация самой плазмиды позволяет ей в «сотрудничестве» с основным геномом бактерии E.coli в присутствии некоего хромогенного субстрата (похожего на лактозу) синтезировать продукт голубого цвета. В результате на чашке с агаром вырастают голубые колонии бактерий. Вставку же чужеродного фрагмента ДНК производят б таком месте, что плазмида утрачивает способность к «сотрудничеству». В результате чего вырастают колонии белого цвета. Их-то и отбирают, чтобы уже в большом объеме жидкой питательной среды наращивать бактериальную массу с плазмидами и чужеродной ДНК. Таким образом решается задача умножения количества («клонирования») интересующей нас ДНК.

Замечу попутно, что описанным выше способом в плазмиду можно вставить так называемый «поликлоновый сайт». Это — синтезированная химически последовательность в несколько десятков пар нуклеотидов, подобранная таким образом, что в ней содержатся сайты узнавания доброй дюжины различных рестрик-таз. Это существенно расширяет возможности эксперимента.

Некоторые приемы экспериментальной микробиологии

Мне только что пришлось использовать термины: «чашка с агаром», «колонии бактерий». Поскольку специализация в области молекулярной биологии требует понимания методов и хорошего владения приемами микробиологии, следует пояснить о чем идет речь.

Когда для лабораторных нужд наращивают значительное количество бактерий, это делают в больших колбах, наполненных жидкой питательной средой. Такие среды готовят и продают в сухом виде специализирующиеся на этом фирмы. Для сохранения доступа воздуха колбы закрывают ватными тампонами (обернутыми в марлю) и стерилизуют в автоклаве. После «инокуляции» — внесения в них малой порции бактерий колбы выдерживают в «теплой комнате», где поддерживается температура 37°С, в течение ночи. При этом их устанавливают на механической качалке ради улучшения аэрации. За ночь среда становится мутной — такое в ней нарастает количество бактерий. Их нетрудно собрать центрифугированием. В микробиологической промышленности в огромных стальных ферментерах с принудительной аэрацией наращивают тонны (1) бактерий. Затем из них выделяют вещества, используемые в качестве пищевых добавок к корму скота или в фармакологии.

 Скачать реферат